Pewarnaan SitoHistoteknologi

METODE PEMBUATAN SEDIAAN, FIKSASI,

DEHIDRASI & PENJERNIHAN

A. METODE PEMBUATAN SEDIAAN

1. Metode Oles (Smear Methods)

Adalah suatu pembuatan sediaan dengan jalan mengoles / membuat selaput (film) dari substansi yang berupa cairan atau bukan cairan diatas gelas benda yg bersih dan bebas lemak, untuk selanjutnya kmd difiksasi, diwarnai dan ditutup dengan gelas penutup.

Bahan yang sering dibuat sediaan oles : darah, nanah / jaringan-jaringan tertentu. Cara ini sangat baik untuk mempelajari : sitologi darah, sumsum tulang merah, eksudat dari bermacam-macam jaringan yg meradang.

Contoh pembuatan sediaan oles :

- Pembuatan sediaan darah tipis

- Pembuatan sediaan oles dari jaringan

- Pembuatan sediaan darah tebal

- Pembuatan sediaan nanah yang tebal (nanah diencerkan dahulu dgn serum / cairan lain, bila keruh, disentrifugasi, endapan diencerkan lagi, siap dioleskan)

Beberapa pewarnaan sediaan oles : Pewarnaan Giemsa, Pewarnaan May Grunwald (larutan eosin-methylen blue dlm methyl alkohol), Pewarnaan Pappenheim, Pewarnaan Wright.

2. Metode Rentang (Spread)

Adalah suatu metode pembuatan sediaan dengan cara merentangkan suatu jaringan pada permukaan gelas benda sehingga dapat diamati dengan mikroskop.

Bahan yang dibuat jaringan yang tipis, misal : pleura, mesenterium, peritoneum, pericardium, dsb. Dapat diamati tanpa pewarnaan / dengan pewarnaan Mallory-Acid Fuchsin : Hematoksilin ; Azure II-Eosin.

3. Metode Pencet (Squash)

Adalah metode untuk mendapatkan suatu sediaan dengan cara memencet suatu potongan jaringan atau suatu organisme secara keseluruhan sehingga didapatkan suatu sediaan yang tipis yang dapat diamati dengan mikroskop.

Digunakan untuk jaringan yang sel-selnya mudah lepas, misal : lien, sumsum tulang, tumor seluler dll. Diambil ± 1 mm. Pewarnaan yang digunakan : Larutan Carmine.

4. Metode Supravital

Adalah metode untuk mendapatkan sediaan dari sel / jaringan yang hidup.

Zat warna : Janus Green, Neutral Red, Methylen Blue dengan konsentrasi tertentu. Bahan : darah, epithelium mukosa mulut.

5. Metode Irisan

Suatu metode pembuatan sediaan dengan jalan membuat suatu irisan dengan tebal tertentu sehingga dapat diamati dengan mikroskop.

Ada 2 macam metode irisan :

- Metode irisan dengan tangan

- Metode irisan dengan mikrotom

 Metode Irisan dengan Mikrotom

Keuntungan : tebal irisan dapat diatur menurut tujuan dan kehendak pemeriksa.

 Macam-macam Mikrotom

1. Mikrotom geser (Sliding Microtome)

Disini jaringan tetap pada tempatnya sedangkan pisaunya yang bergerak. Jaringan yang akan dipotong adalah jaringan yang tanpa penanaman (embedding) terlebih dahulu. Irisan dikumpulkan pada wadah berisi air, disini pisau dan kuas harus basah.

2. Mikrotom beku (Freezing Microtome)

Alat dihubungkan dengan tabung yg berisi CO2 dingin melalui suatu pipa karet. Disini jaringan tetap berada pada tempatnya, sedang pisau yang bergerak ke muka dan ke belakang. Digunakan dalam sediaan irisan dengan metode beku.

3. Mikrotom putar (Rotary Microtome)

Disini pisau tetap pada tempatnya sedangkan jaringan yang bergerak keatas dan kebawah. Digunakan untuk pembuatan sediaan irisan dengan metode paraffin.

Cara ini banyak digunakan karena irisan yang diperoleh lebih tipis dibanding metode lain dan hampir semua jaringan dapat diiris dengan mikrotom ini.

Disini irisan jaringan yang terjadi satu sama lain saling bergandengan sehingga terbentuk pita yang panjang.

B. FIKSASI

Suatu usaha untuk mempertahankan elemen-elemen sel / jaringan agar tetap pada tempatnya dan tidak mengalami perubahan bentuk dan ukuran. Zat yang digunakan : fiksatif.

Fiksatif :

- Mempunyai kemampuan mengubah indeks bias bagian sel sehingga mudah dilihat dengan mikroskop.

- Membuat jaringan mudah menyerap zat warna.

Lama fiksatif tergantung :

- Macam jaringan

- Tebal tipisnya jaringan

- Macam fiksatif yang dipergunakan.

Macam-macam fiksatif

a. Larutan fiksatif sederhana

Hanya mengandung satu macam zat saja. Misal : etanol 70-100% ; Formaldehyde 4-10% ; Asam asetat 0,3-5% ; Asam pikrat ; asam Chromiat 0,5-1 % dll.

b. Larutan Fiksatif Majemuk / campuran

Mengandung lebih dari satu macam zat. Misal : larutan Bouin (asam pikrat, formalin dan asam asetat glasial) ; Larutan Zenker (merkuri chlorida, potassium dichromate, aquadest) dll.

Larutan Zenker : Nuklei dan jaringan pengikat sangat terpulas baik terutama jaringan tumor.

C. DEHIDRASI

Adalah penarikan molekul air dari dalam jaringan. Dilakukan setelah proses fiksasi, kegagalan / ketidaksempurnaan pada proses ini menyebabkan kegagalan pada langkah selanjutnya.

Sel pada jaringan hidup mengandung air ± 85% , air tidak tercampur dengan paraffin / seloidin sehingga perlu dehidrasi. Kemikalia yang digunakan : ethanol, Dioxane, Acetone dsb. Dehidrasi menggunakan alkohol bertingkat mulai konsentrasi rendah sampai absolut.

D. PENJERNIHAN

- Kemikalia berfungsi membuat jaringan menjadi jernih dan transparan.

- Merupakan perantara antara proses dehidrasi dengan proses penanaman.

- Bila memakai alkohol pada dehidrasi perlu dilakukan dealkoholisasi.

- Waktu yang dipergunakan tergantung dari : tebal jaringan, zat penjernih yang dipergunakan.

- Macam-macam zat penjernih :

- Xylol / Xylene

Kebaikan : prosesnya cepat, mudah didapat. Kejelekan : jaringan dapat dipindahkan ke kemikalia ini hanya dari alkohol absolut.

- Toluol / Toluene

Kebaikan : harga murah, mudah didapat, prosesnya cepat dan jaringan menjadi jernih. Kejelekan : Bila terlalu lama dalam toluen jaringan menjadi keras dan sukar diiris, jaringan dapat dipindahkan kesini dari alkohol absolut.

- Minyak Cedar

Kebaikan : hanya sedikit mengerutkan jaringan. Kejelekan : prosesnya lambat.

- Chloroform

Kebaikan : hanya sedikit pengerutan, dapat digunakan untuk jaringan-jaringan yang besar. Kejelekan : mahal dan sukar dipindahkan ke paraffin

- Minyak Cengkeh

Kebaikan : proses cepat, jaringan dapat dipindahkan langsung dari alkohol 95 % , hanya sedikit pengerutan. Kejelekan : mahal harganya, sukar untuk memindahkan jaringan ke paraffin.

- Minyak Anilin

Kebaikan : proses cepat, dapat dipindahkan langsung dari alkohol 70 % dan hanya sedikit mengerutkan jaringan. Kejelekan : sukar dipindahkan ke parafin.

- n – Butyl Alkohol

Kebaikan : sangat baik untuk objek-objek yang keras dan padat. Kejelekan : memerlukan waktu lama.

METODE PARAFIN

 Kebaikan metode ini :

1. Irisan dapat jauh lebih tipis daripada menggunakan metode beku / seloidin (tebal irisan > 10 µ) dengan metode parafin tebal irisan 6 µ.

2. Irisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah

3. Prosesnya jauh lebih cepat.

 Kejelekan :

1. Jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah.

2. jaringan yang besar tidak dapat dikerjakan

3. Sebagian besar enzim akan larut

 Urutan kerja pembuatan sediaan irisan dengan metode parafin :

Fiksasi ; pencucian (washing) ; dehidrasi ; penjernihan ; infiltrasi parafin ; penanaman (embedding) ; penyayatan (section) ; penempelan (affiksing) ; deparafinasi ; pewarnaan (staining) ; penutupan (mounting) ; labelling.

METODE PARAFIN

Fiksasi

Organ yang diambil segera difiksasi, kalau diperlukan sebelum difiksasi dicuci dulu dengan larutan garam difisiologis.

Pencucian

Untuk menghilangkan larutan fiksasi dari jaringan dilakukan beberapa kali dengan cermat dan teliti.

Dehidrasi

Untuk menarik air yang terdapat didalam jaringan agar nantinya seluruh ruang antar sel dalam jaringan dapat diisi oelh molekul-molekul parafin.

Dehidran yang paling banyak digunakan : alkohol (dari prosentasi rendah sampai yang absolut) setingkat demi setingkat karena untuk menjaga agar tidak terjadi perubahan yang tiba-tiba terhadap sel jaringan sehingga perubahan struktur sel yang terjadi sekecil mungkin.

Penjernihan

ntuk menarik alkohol/ dehidran lain dalam jaringan agar nantinya dapat digantikan molekul parafin.

Infiltrasi Parafin

Dipilih parafin yang titik cairnya 50-56OC. Sebaiknya jaringan jangan dimasukkan langsung dari zat penjernih ke parafin murni tetapi kedalam campuran zat penjernih-parafin murni untuk menghindari perubahan lingkungan yang sangat mendadak terhadap jaringan sehingga jaringan dapat mengerut.dll.

Dalam campuran : selama 10 – 30 menit

Parafin murni I : 30 – 60 menit \

Parafin murni II : 30 – 60 menit } Tujuan : Agar jaringan mendapatkan

Parafin murni III : 30 – 60 menit / parafin yang betul murni.

Juga untuk mencegah tertahannya sejumlah besar zat penjernih didalam jaringan yang akan melunakkan jaringan dan membuat jaringan sukar diiris.

Penanaman Dalam Jaringan

Parafin yang digunakan mempeunyai titik cair yang sama dengan parafin untuk infiltrasi. Setelah jaringan dianggap cukup waktunya dalam parafin III tuangkan parafin murni kedalam kotak karton hingga penuh.

Ambil jaringan dengan cepat dari parafin III masukkan kotak yang berisi parafin cair dan usahakan tidak terjadi gelembung udara didalam blok, gelembung udara terjadi karena kecepatan pembekuan parafin yang tidak sama didalam kotok karton.

Penyayatan

Bila akan menempelkan irisan jaringan pada gelas benda, maka disiapkan dahulu alat / bahan sebagai berikut :

1. Gelas benda

2. Albumin Mayer untuk merekatkan jaringan pada gelas benda

3. Meja pemanas (hot Plate) : tempat pemanasan yang berfungsi untuk merentangkan irisan jaringan dan merekatkan jaringan pada gelas benda.

4. Pipet tetes

5. Aquadest

6. Sonde

Cara penempelan :

Teteskan setetes albumin Mayer pada gelas benda dan diratakan seluruh permukaan. Tetesilah aquadest (agar irisan jaringan yang akan diletakkan terentangm tidak melipat), lalu jaringan diletakkan dan angkat gelas benda letakkan pada meja pemanas. Atur letak irisan dengan 2 sonde. Dalam satu gelas benda dapat ditempel 1-2 irisan tergantung besar kecilnya jaringan. Setelah kering, siap untuk diwarnai tetapi dapat juga disimpan untuk beberapa hari.

Pewarnaan

Deparafinasi : menghilangkan parafin yang terdapat didalam jaringan. Caranya : merendam gelas benda yang berisi irisan jaringan kedalam Xylene ± 15 menit.

Berikutnya : Masukkan kedalam alkohol 96 %, 80 %, 70 %, dst sampai aquadest dengan waktu beberapa detik / 3-4 kali celupan. Masukkan kedalam larutan zat warna aquosa.

Pewarnaan Hematoxylin-Eosin

- Deparafinasi dengan xylene

- Kelebihan xylene diisap dengan kertas filter melalui tepi gelas benda.

- Celup sebentar dalam alkohol 96%, kemudian 80%, 70%, 50%, 30%, aquadest.

- Masukkan kedalam larutan Hematoxylin dengan waktu tertentu : 3-7 detik.

- Air mengalir : 10 menit. Cuci aquadest sebentar.

- Masukkan sebentar saja berturut-turut mulai dari alkohol 30%, 50%, 70%.

- Kemudian kedalam larutan eosin 0,5% (dalam alkohol 70%) 1-3 menit.

- Pewarnaan selesai, tetapi jaringan tidak dapat ditutup langsung dengan Canada balsam, karena Canada balsam dilarutkan dalam xylene, sedangkan jaringan masih berada dalam media alkohol 70% sehingga jaringan harus dibawa ke media xylene dulu.

- Dari larutan eosin 0,5% (dalam alkohol 70%) selanjutnya berturut-turut masukkan ke alkohol 70%, 80%, 96%, alkohol absolut, masing-masing sebentar saja.

- Masukkan xylene ± 10 menit (xylene berfungsi untukl mengantar ke canada balsam juga berfungsi untuk menjernihkan jaringan yang sudah terpulas).

- Jrigan ditutup dengan gelas penutup setelah ditetesi dengan Canada balsam terlebih dahulu.

Pelabelan

Label dituliskan : nama spesies, nama organ / jaringan, potongan melintang / membujur, pewarnaan yang digunakan, tanggal pembuatan.

Metode Pewarnaan

Metode Hasil

Hematoxylin-Eosin Biru (hematoxylin)

Sitoplasma basofilik, nukleus, bakteri, Ca. Merah (eosin)

Sitoplasma, jaringan ikat dan semua jaringan lain. 

Van Gieson Kuning (as. pikrat)

Sitoplasma, otot, amiloid, fibrin, fibrinoid. Merah (fuchsin)

Jaringan ikat, hyalin. Hitam (iron hematoxylin)

Nukleus

Elastic Stain Hitam (resorchin-fuchsin)

Serabut elastik

Merah (nuklear fast red)

Nukleus 

Elastic-Van Gieson (E.V.G) Kombinasi 

Azan Merah (Azocarmine)

Nukleus, eritrosit, fibrin, fibrinoid, sitoplasma acidofilik Biru (Aniline blue, Orange G)

Serabut kolagen, sitoplasma basofilik, mukus. 

Silver Stain Hitam (ammoniakal AgNO3)

Serabut retikulum, serabut saraf. Abu-abu

Serabut kolagen 

Fat stain Merah (Sudan III, Scarlet Red)

Lemak netral Biru (Hematoxylin)

Nukleus, sitoplasma 

Congo Red Merah (Congo Red)

Amyloid Biru (Hematoxylin)

Nukleus 

Weigerts Fibrin Stain Biru (Lugol Solution)

........

Merah (Nuclear Fast Red)

...................... 

Berlin Blue Reaction Biru (Ca. Ferrocyanid)

Hemosiderin, Fe3+ Merah (Nuclear Fast Red)

Nukleus 

Giemsa Biru (metil violet)

Nukleus, semua substansi basofilik. Merah (azur-eosin)

Eosinofil, sitoplasma, granula, serabut kolagen. 

Ziehl-Neelsen Merah (carbol Fuchsin)

Basil tbc, Lepra Biru

Hemalum

Nukleus 

Periodic Acid Schiff Reaction (PAS) Merah (Schiff Reagent)

Adjacent hydroxyl Groups & amino-alkohol. 

PERIODIC ACID SCHIFF (PAS)

Prinsip :

Setelah pengecatan karbohidrat dipecah oleh periodic acid menjadi aldehid dan aldehid bereaksi dengan reagen Schiff membentuk warna merah.

Reagen :

Asam Periodat 0,5% dan Schiff (100 ml)

Reagen Schiff :

1 gr Basic Fuchsin dilarutkan dalam 200 cc aquades panas, dinginkan 50OC. Tambah bubuk padat sodium metabisulfid 2 gr, kocok sampai rata. Tambahkan HCl 10 cc, diamkan pada suhu kamar yang gelap 24 jam. Setelah itu tambah norit 0,5 gr kocok sampai rata (merah jadi hitam), pada pemakaian disaring hingga jernih.

Prosedur :

- Deparafinisasi, cuci dengan air.

- Tambahkan periodic acid selama 5 menit, tambahkan cat Schiff selama 15 menit. Cuci air 15-20 menit (sampai jaringan berwarna merah muda)

- Beri reagent Harris Hematoksilin 6 menit, cuci dgn air untuk melarutkan Harris Hematoksilin.

- Beri acid alkohol 3-5 menit

- Cuci dengan air, baru kmd diberi amonium water sampai warna biru hilang.

- Lakukan dehidrasi, clearing, mounting.

Interpretasi :

Sitoplasma merah

KANKER

Kanker adalah suatu pertumbuhan sel-sel abnormal yang cendrung menginvasi jaringan disekitarnya dan menyebar ke tempat-tempat jauh.

Kategori kanker

- Karsinoma adalah kanker jaringan epitel termasuk sel-sel kulit, testis, ovarium, kelenjar penghasil mukus, sel penghasil melanin, payudara, serviks, kolon, rektum, lambung, pankreas dan esophagus.

- Limfoma adalah kanker jaringan limfe yang mencakup kapiler limfe, limpa, berbagai kelenjar limfe dan pembuluh limfe. Timus dan sumsum tulang juga dapat dipengaruhi. Limfoma spesifik antara lain penyakit Hodgkin (kanker kelenjar limfe dam limpa) dam Limfoma Malignum.

- Sarkoma adalah kanker jaringan ikat, termasuk sel-sel yang ditemukan di otot dan tulang.

- Glioma adalah kanker sel-sel glia (penunjang) di susunan saraf pusat.

- Karsinoma in situ adalah istilah yang digunakan untuk menjelaskan sel epitel abnormal yang masih terbatas di daerah tertentu sehingga masih dianggap lesi pra invasif.

Patogenesa :

Etiologi tidak jelas, ada beberapa teori :

- Genetik - Hormon

- Lingkungan - Virus

Teori Genetik

Keganasan terjadi akibat dari mutasi gen yang mempengaruhi proses pertumbuhan kemudian berkembang abnormal (ganas).

Teori Lingkungan

Keadaan lingkungan bisa mendorong/merangsang terjadinya keganasan. Misal : lingk. Pabrik banyak menghasilkan bahan carcinogenik.

Teori Hormon

Hormon dapat menyebabkan keganasan . misal : estrogen pada pil KB dikombinasi dgn progesteron sehingga tidak begitu bahaya.

Teori Virus

- Virus dalam tubuh mempunyai efek lisis steady state effect, incorporated.

- Incorporated : terjadi ikatan antara DNA/RNA virus dengan DNA sel sehingga ganas. Sel yang ganas pada keadaan yang memungkinkan : Inisiator dan Promotor

- Inisiator : bahan /jasad renik yang menyebabkan carcinogenesis

- Promotor : Bahan dari lingkungan / jasad renik / sesuatu yang dapat mendorong terjadinya carcinogenesis.

- Promotor dan inisiator pada proses carcinogenesis bekerja satu sama lain.

CARCINOGENESIS CERVIC

Cervic merupakan pertemuan antara epitel columnar (dalam uteri) dan Squamosa vagina, seringterjadi keganasan.

Carsinoma Cervic dapat dideteksi dengan metode PAP Smear. Faktor insidense adalah :

- Sex terlalu muda (<17 tahun)

- Ganti-ganti pasangan.

- Wanita yang banyak melakukan perkawinan

- Tingkat sosial ekonomi yang berhubungan hygiene sanitasi.

Deteksi :

1. PAP Smear

2. Schiller Test

3. Biopsi Kemudian diperiksa secara Patologi Anatomi

Keterangan :

Schiller Test adalah suatu cara dgn pengecatan biasa dgn larutan Iodium dab Potassium Chlor.

Prinsip :

Pada sel yang mengalami keganasan jumlah glikogennya kecil, hasilnya pucat. Pada sel-sel normaljumlah glikogen banyak (warna coklat : normal, tidak berwarna ganas) tapi ada juga positif palsu yaitu pada hiperplasia dan displasia. Jumlah glikogen kecil sekali namun juga merupakan gejala dini dari suatu keganasan.

PEWARNAAN PAPANICOLAOU (GURR, 1960)

Reagen yang diperlukan :

a. Hematoxylin Ehrlich / Harris

b. Orange G

- Phosphotungstic Acid 1 % aquosa 1,5 ml

- Alkohol absolut 95 ml

- Aquadest 3,5 ml

c. Papanicolaou 0,7 gram

Alkohol 95 % 100 ml

Letakkan dalam botol dan sumbatlah botol dengan kain katun kemudian panaskan dalam bak yang berisi air panas hingga larut. Dinginkan kemudian saring dengan kertas saring.

Prosedur

1. Sediaan apus yang masih basah, difiksasi dalam campuran eter + alkohol absolut (dalam volume yang sama) selama 5-15 menit.

2. Cuci berturut-turut dalam alkohol 90%, 70% dan 50%.

3. Cuci dalam aquadest

4. Warnai dalam Hematoxylin Ehrlich / Harris selama 5-10 menit.

5. Cuci lagi dalam aquadest

6. Diferensiasi dalam 0,5% HCl, cuci dalam aquadest.

7. Celup dalam aquadest dimana ditambahkan 3 tetes Lithium Carbonat jenuh dalam setiap 100 ml aquadest.

8. Cuci seluruhnya dalam aquadest

9. Cuci berturut-turut dalam alkohol 50%, 70% dan 90%

10. Warnai selama 1 menit dalam larutan Orange G

11. Cuci seluruhnya dalam alkohol 95% untuk menghilangkan kelebihan zat warna.

12. Warnai selama 2 menit dalam Papanicolaou

13. Cuci selama 5-10 menit dalam setiap Staning Jar yang berisi alkohol 95% (disini ada 3 buah Staining-Jar yang berisi alkohol 95%.

14. Cuci dalam alkohol absolut

15. Jernihkan dalam xylene dan tutup dalam Dpx atau Crystalite.

sumber:
http://ripanimusyaffalab.blogspot.com/2010/01/metode-pembuatan-sediaan-fiksasi.html